Niniejszym wpisem inaugurujemy nowy cykl tematyczny na naszym blogu. Będzie on oczywiście poświęcony roślinom, ale roślinom w nieco odmiennej formie i wydaniu. Pragniemy bowiem przybliżyć Państwu działalność, jaką prowadzi w Laboratorium Zastosowań Biotechnologii i Mikropropagacji Roślin naszego Ogrodu Zespół Biotechnologii Konserwatorskiej. Jako pierwszą przedstawimy Państwu technikę kultur in vitro, jeden z głównych działów nowoczesnej biotechnologii roślin, który odgrywa ważną rolę w badaniach podstawowych, ale też służy celom praktycznym np. masowemu rozmnażaniu roślin, ich doskonaleniu (hodowli nowych odmian) albo pozyskiwaniu z nich cennych metabolitów wtórnych, np. stanowiących surowce do produkcji leków czy kosmetyków.
Kultury in vitro roślin to nic innego jak hodowla komórek, tkanek i organów roślinnych lub ich fragmentów, która jest prowadzona w naczyniach ze szkła – stąd nazwa „in vitro” („w szkle”), aczkolwiek obecnie równie często korzysta się z naczyń i pojemników plastikowych. Te naczynia to najczęściej słoiki różnej wielkości, kolby stożkowe, probówki oraz płytki Petriego, popularnie nazywane szalkami. Kultury w nich utrzymuje się na specjalnie opracowanych, płynnych lub zestalonych do konsystencji żelu czy galaretki pożywkach, w sterylnych, ściśle kontrolowanych warunkach. Możliwość prowadzenia roślinnych kultur in vitro wynika z totipotencji komórek roślinnych, czyli ich zdolności (oczywiście w odpowiednich warunkach, które musimy im zapewnić w naszej kulturze) do odróżnicowania, wznowienia podziałów i przekształcania (inaczej różnicowania) w inne typy komórek, co w konsekwencji umożliwia odtworzenie wyspecjalizowanych organów, a nawet całego organizmu.
Do założenia kultury potrzebny jest eksplantat – wyizolowany z rośliny organ lub jego fragment, tkanka, pojedyncze komórki, a nawet tylko ich protoplasty (tj. komórki pozbawione ściany komórkowej). Eksplantat użyty do inicjacji kultury powinien być zdezynfekowany, dlatego należy poddać go wcześniej procedurze odkażania, ewentualnie pobrać z rośliny już rosnącej w sterylnych warunkach. Taki eksplantat, który pozyskiwany jest z roślin rosnących w warunkach niesterylnych i wymagający odkażenia nazywamy eksplantatem pierwotnym. Eksplantatem wtórnym nazywamy natomiast fragment rośliny pochodzący z kultury in vitro i użyty do zapoczątkowania nowej hodowli. Powierzchniowe odkażenie (dezynfekcję) materiału roślinnego przeprowadza się poprzez zanurzenie go na kilka-kilkadziesiąt minut w roztworze środka dezynfekcyjnego. Najczęściej są to roztwory podchlorynu sodu lub wapnia, chlorku rtęci, chloramina T, rzadziej woda bromowa czy nadtlenek wodoru. Wcześniej fragment rośliny można wstępnie odkazić oraz odtłuścić poprzez krótkie zanurzenie w 70% etanolu. Następnie materiał płucze się kilka razy w sterylnej wodzie i wykłada na przygotowaną wcześniej pożywkę.
Skład pożywki do prowadzenia kultury in vitro ma istotne znaczenie dla jej dalszego rozwoju, a ponieważ zależy od gatunku rośliny, rodzaju eksplantatu, szybkości wzrostu i oczekiwanej indukcji organów, to jego opracowanie wymaga nierzadko długotrwałych eksperymentów. Każda pożywka powinna zawierać wszystkie składniki, które są potrzebne do życia i prawidłowego rozwoju roślin, a wiec sole nieorganiczne (dostarczające niezbędnych makroelementów, takich jak azot, fosfor, potas, wapń, magnez i siarka, mikroelementów, czyli żelaza, manganu, molibdenu, miedzi, jodu, cynku, boru i chloru oraz pierwiastków śladowych: kobaltu, sodu, glinu czy krzemu), węglowodany stanowiące źródło węgla (najczęściej sacharoza i glukoza), witaminy (przede wszystkim z grupy B) i regulatory wzrostu (auksyny, cytokininy, gibereliny, kwas abscysynowy i inne). Niektóre pożywki wzbogaca się również w aminokwasy, kwasy organiczne, przeciwulteniacze, a niekiedy w antybiotyki. Składniki te rozpuszcza się w wodzie, więc tak przygotowana pożywka ma formę płynną. W celu jej zestalenia, czyli nadania konsystencji żelu lub galaretki, stosuje się wytwarzany z krasnorostów agar, wyższej czystości agarozę czy polimery wytwarzane przez bakterie, jak Phytagel lub Gerlite. Pożywka powinna mieć również ustalone pH, a po przygotowaniu powinna zostać poddana procedurze sterylizacji. W naszym laboratorium najczęściej wykorzystujemy pożywkę, której skład opracowali w 1962 roku Toshio Murashige i Folke K. Skoog, czyli tzw. pożywkę MS oraz różne jej modyfikacje, zaś jako substancję zestalającą stosujemy przede wszystkim agar. Ponieważ w miarę wzrostu kultur składniki odżywcze w pożywce ulegają wyczerpaniu, co kilka tygodni należy poddać kultury pasażowi, czyli przeszczepić je na świeżą pożywkę.
Prowadzenie kultur in vitro wymaga posiadania odpowiednio zorganizowanego laboratorium, wyposażonego w kilka kluczowych urządzeń. Jednym z nich jest źródło czystej wody – destylator przeznaczony do oczyszczania wody z rozpuszczonych w niej soli mineralnych i gazów poprzez odparowanie a następnie skroplenie. Woda ta jest wykorzystywanej później do przygotowania roztworów i pożywek do prowadzenia kultur. Kolejny to autoklaw, czyli urządzanie do sterylizacji parą wodną w nadciśnieniu narzędzi, szklanych pojemników do prowadzenia kultur oraz roztworów i pożywek. Wszystkie czynności wymagające jałowych warunków są przeprowadzane w komorach z laminarnym przepływem sterylnego powietrza. Do utrzymywania kultur służą specjalne szafy, komory lub pokoje hodowlane – tzw. fitotrony, pozwalające sterować temperaturą i wilgotnością powietrza oraz zapewniające odpowiednie warunki świetlne. Laboratorium kultur in vitro może mieć różną wielkość i liczbę pomieszczeń, ważne jest jednak, aby oddzielić od siebie pomieszczenia, w których pracuje się niesterylnie, czyli przygotowuje pożywki, szkło, narzędzia czy przeprowadza autoklawowanie, od pomieszczeń, w których dokonuje się inicjacji kultur i pasaży (tzw. pokoje pracy sterylnej) oraz utrzymuje się już założone kultury.
Tekst i zdjęcia: Karolina Tomiczak
Bibliografia:
- Bach A., Pawłowska B. 2009. Procesy rozwojowe w kulturze in vitro i typy kultury. W: Malepszy S. (red) Biotechnologia roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa, 21-40
- Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant. 15 (3): 473-497
- Wykłady i ćwiczenia z roślinnych kultur in vitro (http://www.wbp.olsztyn.pl/~krist/skrypt/start.php)