Omawiany w poprzednim poście (27.04.2020) proces somatycznej embriogenezy jest jednym z głównych tematów badawczych zgłębianych przez nasz zespół w Laboratorium Zastosowań Biotechnologii i Mikropropagacji Roślin. Tworzenie się zarodków z komórek ciała rośliny, z pominięciem zapłodnienia, badane było w naszym ogrodzie przez niemal 20 lat, w dodatku u różnych gatunków goryczek. Zebrane w trakcie tych badań doświadczenie pozwoliło w ostatnich latach odkryć i opisać po raz pierwszy na świecie proces somatycznej embriogenezy u paproci.
Goryczki, czyli rośliny należące do rodzaju Gentiana, choć występują głównie na obszarach górskich, są szeroko znane i cenione przez człowieka ze względu na piękno swoich dzwonkowatych kwiatów oraz na właściwości lecznicze, odkryte już w starożytności. Z powodu tych zalet naturalne populacje goryczek mogą być niestety nadmiernie eksploatowane i przez to narażone na zniszczenie. Dlatego zainteresowano się namnażaniem goryczek (podobnie zresztą jak i innych gatunków roślin ozdobnych i leczniczych) w warunkach in vitro. W naszym laboratorium goryczki pojawiły się w latach 90-tych XX w. za sprawą Pani prof. dr hab. Anny Mikuły, obecnej kierownik Zespołu Biotechnologii. Okazały się niesamowicie ciekawym i wdzięcznym obiektem badań, m.in. dzięki wysokim zdolnościom do regeneracji na drodze somatycznej embriogenezy. Do dnia dzisiejszego proces somatycznej embriogenezy zaindukowano i opisano dla dwunastu gatunków goryczek, z czego dla sześciu w naszym laboratorium. Jako eksplantaty posłużyły niedojrzałe zarodki zygotyczne pobierane z niedojrzałych nasion, korzenie, hypokotyle i liścienie siewek, które wykiełkowały z nasion wysianych in vitro, liście i korzenie pobierane z hodowanych w szkle roślin oraz agregaty zawiesin komórkowych otrzymane z tkanki kalusowej różnego pochodzenia. Na drodze somatycznej embriogenezy zregenerowano również goryczki z protoplastów czyli pojedynczych komórek enzymatycznie pozbawionych ściany komórkowej. W zdecydowanej większości przypadków u goryczek obserwowano embriogenezę pośrednią, czyli na eksplantatach najpierw powstawała tkanka kalusowa, a dopiero z komórek kalusa regenerowały zarodki. Opisano jednak również przypadki embriogenezy bezpośredniej. W ogromnej większości kultur zastosowano pożywkę MS czyli pożywkę opracowaną przez Murashige i Skooga w 1962 r oraz jej modyfikacje.
W pierwszych doświadczeniach wykonywanych w naszym laboratorium wykorzystywano siewki, które wykiełkowały z nasion uprzednio poddanych dezynfekcji i wysianych na płytki Petriego z pożywką ½MS (tj. zawierającą połowę makro- i mikroelementów pożywki Murashige i Skooga) z dodatkiem kwasu giberelinowego. Siewki te dzielono na 4 części: korzeń, hypokotyl i dwa liścienie, a następnie wykładano osobno na pożywkę MS z dodatkiem auksyny i cytokininy, aby zaindukować namnażanie komórek i w efekcie uzyskać embriogeniczny kalus. Modyfikacja pożywki (najczęściej wycofanie auksyny i dodanie kwasu giberelinowego) skutkowała regeneracją zarodków somatycznych. Na pojedynczym eksplantacie uzyskiwano od kilku do nawet kilkudziesięciu zarodków, co oznacza, że z pojedynczej siewki, z której pobierano w sumie 4 eksplantaty, możliwe było otrzymanie nawet do stu zarodków. Jeszcze wydajniejszą metodą okazało się przeniesienie embriogenicznego kalusa do kolby z pożywką płynną i wyprowadzenie zawiesiny komórkowej. Takie zawiesiny o bardzo wysokiej zdolności do regeneracji zarodków somatycznych uzyskano w naszym laboratorium dla polskiej goryczki krzyżowej (Gentiana cruciata L.), pięknej wschodnioalpejskiej goryczki panońskiej (G. pannonica Scop.), uprawianej również w naszych ogrodach goryczki tybetańskiej (G. tibetica King) oraz zagrożonej wyginięciem goryczki himalajskiej (G. kurroo Royle).
Po odsączeniu z pożywki płynnej i wyłożeniu na pożywkę agarową zaledwie 100 mg agregatów komórkowych (czyli co najwyżej 5% tkanki hodowanej w jednej kolbie) regenerowano kilkaset zarodków. Zważywszy, że raz wyprowadzona zawiesina komórkowa dzięki nieustannym podziałom komórkowym intensywnie się namnaża, a w dodatku możliwe jest jej utrzymanie przez kilka lat, nietrudno sobie wyobrazić, jak efektywnym źródłem zarodków i roślin potomnych może się stać ten typ kultury.
Somatyczna embriogeneza na eksplantatach liści i korzeni goryczek nie jest aż tak wydajna. Komórki w tych organach są znacznie bardziej zróżnicowane i wyspecjalizowane do pełnienia określonych funkcji. Wciąż jednak na odpowiedniej pożywce mogą stosunkowo łatwo ulec odróżnicowaniu i zacząć się dzielić tworząc kalus. Badania prowadzone w pracy doktorskiej przez naszą koleżankę (obecnie dr hab.) Agnieszkę Fiuk pokazały, że średnio na pojedynczym eksplanacie (czyli fragmencie) liścia można otrzymać kilka-kilkanaście zarodków. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że roślina ma zazwyczaj co najmniej kilka liści, a każdy liść da się podzielić na co najmniej kilka fragmentów (eksplantatów), to nadal możemy mówić o zupełnie bogatym źródle zarodków i nowych roślin. Jak jednak wspominałam w ostatnim wpisie, zdolność do somatycznej embriogenezy zależy m.in. od gatunku rośliny. Choć większość gatunków goryczek, z którymi mieliśmy do czynienia, pozytywnie reagowała na warunki kultury, to najbardziej popularna w Europie goryczka żółta (G. lutea L.) pozostawała przez lata „nieczuła” na stosowane przez nas pożywki i regulatory wzrostu. Dopiero użycie przez Irinę Holobiuc mannitolu, który spowodował podniesienie ciśnienia osmotycznego pożywki, zaowocowało indukcją somatycznej embriogenezy na eksplantatach hypokotyli siewek tego gatunku.
Więcej zdjęć i informacji na temat somatycznej embriogenezy nie tylko u goryczek, ale i innych roślin z rodziny goryczkowatych mogą Państwo znaleźć w artykule przeglądowym, opublikowanym przez nas w specjalnym zeszycie czasopisma Frontiers in Plant Science, wydanym z okazji 60-lecia odkrycia zjawiska somatycznej embriogenezy: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.00762/full. Natomiast w kolejnym wpisie opowiem o tym, jak przebiega somatyczna embriogeneza u paproci.
Tekst: dr Karolina Tomiczak
Zdjęcia: Karolina Tomiczak, Agnieszka Niedziela, Wikiwand (zdjęcie goryczki panońskiej)
Bibliografia:
- Fiuk, A., and Rybczyński, J. J. 2008. Genotype and plant growth regulator dependent response of somatic embryogenesis from Gentiana spp. leaf explants. In Vitro Cell. Dev. -Plant 44, 90-99. DOI: 10.1007/s11627-008- 9124-3
- Holobiuc I. 2015. Somatic embryogenesis in long-term cultures of Gentiana lutea in the presence of osmotic stress. In: The Gentianaceae Vol. 2. Biotechnology and Application., eds J. J. Rybczyński, M. R. Davey, A. Mikuła, (Springer- Verlag: Berlin), 139-161. DOI: 10.1007/978-3-642-54102-5_6
- Mikuła A., Wesołowska M., Kapusta J., Skrzypczak, L., and Rybczyński J. J. 1996. Cytomorphological studies on somatic embryogenesis of Gentiana tibetica (King) and G. cruciata (L.). Acta Soc. Bot. Pol. 65, 47—51. DOI: 10.5586/asbp.1996.008
- Tomiczak K., Mikuła A., Niedziela A., Wójcik-Lewandowska A., Domżalska L., Rybczyński J.J. 2019. Somatic embryogenesis in the family Gentianaceae and its biotechnological application. Frontiers in Plant Science 10:762, DOI: 10.3389/fpls.2019.00762
Pełne opisy do zdjęć:
- Wybrane gatunki goryczek badane przez nasz zespół: goryczka żółta (A), panońska (B), krzyżowa (C) i tybetańska (D)
- Embriogeniczna zawiesina komórkowa goryczki w kolbie stożkowej
- Agregaty zawiesiny komórkowej pod mikroskopem
- Roślinki otrzymane drogą somatycznej embriogenezy ze 100 mg zawiesiny komórkowej