W niniejszym wpisie zaprezentuję kolejne rodzaje roślinnych kultur in vitro, tym razem nieco bardziej zaawansowane od opisywanych ostatnio. Są to kultury, w których jako eksplantaty wykorzystuje się określone fragmenty kwiatów zawierające męskie lub żeńskie gametofity, a efektem tych kultur są rośliny haploidalne o gametycznej, czyli zredukowanej o połowę liczbie chromosomów.
Kultury mikrospor i pylników to kultury, w których eksplantatami są albo całe pylniki, albo izolowane z nich mikrospory, czyli niedojrzałe ziarna pyłku. Pylniki to te elementy pręcika, które budują jego główkę. Wycina się je na odpowiednio wczesnym etapie rozwoju, gdy kwiat jest jeszcze niedojrzały, odkaża i po usunięciu nitki pręcikowej przenosi całe na pożywkę. Drugą możliwością jest izolowanie z odkażonych pylników mikrospor i przeniesienie na pożywkę tylko ich. Kultury pylników prowadzi się najczęściej na pożywkach agarowych, zaś kultury izolowanych mikrospor na pożywkach płynnych. W odpowiednich warunkach kultury mikrospory izolowane lub zawarte w pylnikach nie rozwijają się w ziarna pyłku, lecz w haploidalne zarodki, z których mogą powstać haploidalne rośliny. Cały proces rozwoju rośliny z mikrospory nazywamy androgenezą, a powstałe w ten sposób zarodki – androgenicznymi (w odróżnieniu od opisywanych ostatnio zarodków somatycznych). Na indukcję androgenezy i procent zregenerowanych roślin z zarodków mikrosporowych mają wpływ liczne czynniki: gatunek rośliny, genotyp w obrębie gatunku, kondycja rośliny donorowej, faza rozwojowa mikrospor, skład pożywek czy warunki kultury in vitro. Niezbędne jest m.in. zastosowanie jednego lub kilku czynników stresowych, takich jak niska lub wysoka temperatura czy niedobór węglowodanów (tzw. głodzenie kultury, które można uzyskać m.in. poprzez zastąpienie sacharozy w pożywce mannitolem, którego rośliny nie są w stanie wykorzystać jako źródło węgla). Najlepsze wyniki androgenezy uzyskuje się u roślin zbożowych, kapustnych i psiankowatych. U zbóż częstym niekorzystnym efektem obserwowanym u roślin androgenicznych jest niestety albinizm spowodowany zaburzeniami w syntezie chlorofilu – zielonego barwnika roślin.
Kultury zalążków lub całych zalążni to kultury, w których eksplantatami są albo całe niezapylone zalążnie pobierane z odkażonych słupków kwiatów lub izolowane z zalążni zalążki. Wykłada się je na agarowe pożywki o ustalonym wcześniej składzie. Podobnie, jak w przypadku androgenezy, w odpowiednich warunkach kultury może dojść do formowania zarodków gynogenicznych i regeneracji całych, haploidalnych roślin. Wydajność gynogenezy jest mniejsza niż androgenezy, ponieważ w pojedynczym kwiecie rozwija się zazwyczaj o wiele mniej zalążków niż ziaren pyłku. Metoda ta została też zoptymalizowana tylko dla kilkudziesięciu gatunków roślin (np. cebuli, buraka, gerbery, tytoniu, ryżu), podczas gdy androgenezę uzyskano u ponad 250 gatunków.
Oba rodzaje embriogenezy (androgeniczna i gynogeniczna) mogą przebiegać bezpośrednio, gdy zarodki rozwijają się wprost z komórek wyłożonych eksplantatów, jak i pośrednio, kiedy ich regenerację poprzedza faza kalusa. Oba procesy prowadzą do otrzymania roślin haploidalnych, które są bardzo ważne z punktu widzenia hodowlanego: są świetnym materiałem do badań molekularnych, a przede wszystkim pozwalają w bardzo szybkim czasie uzyskać tzw. czyste, stabilne genetycznie linie wykorzystywane do krzyżowań. Te czyste linie nazywa się podwojonymi haploidami (w skrócie DH), ponieważ powstają w drodze podwojenia liczby chromosomów u haploidów. Podwojenie liczby chromosomów u haploidów czasem zachodzi spontanicznie, ale można je też stosunkowo łatwo zaindukować poprzez traktowanie haploidów specjalnymi związkami zaburzającymi proces segregacji chromosomów podczas podziału komórek – kolchicyną lub oryzaliną. Metody otrzymywania linii DH pozwalają na znaczne skrócenie procesu hodowlanego (średnio z 10 do około 3 lat), co jest niezwykle istotne dla hodowców poszukujących nowych odmian.
Pisząc o otrzymywaniu roślin haploidalnych nie sposób wspomnieć o jeszcze jednej metodzie, stosowanej przede wszystkim u zbóż. Haploidy można bowiem uzyskać również poprzez krzyżowanie oddalone, czyli krzyżowanie dwóch różnych gatunków, należących nierzadko wręcz do różnych rodzajów. Najczęściej wykorzystywana metoda bulbozowa polega na krzyżowaniu jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) z jęczmieniem bulwiastym (Hordeum bulbosum), który jest dawcą pyłku. W wyniku takiego krzyżowania chromosomy jęczmienia bulwiastego ulegają eliminacji, zaś chromosomy jęczmienia zwyczajnego pozostają, w efekcie czego otrzymuje się haploida jęczmienia zwyczajnego. Również w celu uzyskania haploidów można krzyżować żyto z Hordeum bulbosum, pszenicę z kukurydzą lub pszenicę z kozieńcem. W tego typu doświadczeniach zapylenie przeprowadza się w warunkach polowych(czyli ex vitro), natomiast po 16-18 dniach od zapylenia izoluje się zarodki i umieszcza na jałowej pożywce, gdzie prowadzi się dalszą kulturę.
Tekst: dr Karolina Tomiczak
Zdjęcia: Doi i inni 2010, 2011.
Bibliografia:
- Górska K., Kaszuba M., Ligman S., Pluskota W., Wojciechowicz J., Źróbek-Sokolnik A., Michalczyk D.J. 2011. Wykłady i ćwiczenia z roślinnych kultur in vitro (http://www.wbp.olsztyn.pl/~krist/skrypt/start.php)
- Doi H., Takahashi R., Hikage T., Takahata Y. 2010. Embryogenesis and doubled haploid production from anther culture in gentian (Gentiana triflora). Plant Cell Tiss Organ Cult 102: 27-33
- Doi H., Yokoi S., Hikage T., Nishihara M., Tsutsumi K., Takahata Y. 2011. Gynogenesis in gentians (Gentiana triflora, scabra): production of haploids and doubled haploids. Plant Cell Rep. 30 (6): 1099-106
- Majewska-Sawka A. 2012. Otrzymywanie haploidów. W: Malepszy S. (red.) Biotechnologia roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, s. 87-99
- Musiał K., Przywara L. 2001. Gynogeneza u roślin. Kosmos. Problemy Nauk Biologicznych 50 (1-2): 39-48
- Niemirowicz-Szczytt K. 2005. Kultura pylników i mikrospor. W: Malepszy S. (red.) Biotechnologia roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, s. 42-53
Na zdjęciach:
- Androgeneza u goryczki (Gentiana triflora): zarodek androgeniczny regenerujący z pylnika po 2 miesiącach kultury (a); konwersja zarodka w roślinę (b); roślina otrzymana z zarodka po 5 miesiącach kultury (c); androgeniczna roślina przesadzona do doniczki (d)
- Gynogeneza u goryczki (Gentiana triflora): niezapłodnione zalążki wewnątrz zalążni (a); zalążki wyłożone na pożywce (b); zarodki gynogeniczne regenerujące z zalążków (c-d); roślina otrzymana z zarodków gynogenicznych (e-f); gynogeniczna roślina w doniczce (g); 13 chromosomów widocznych w komórce haploidalnej rośliny, podczas gdy typowa dla tego gatunku liczba chromosomów wynosi 26 (h)